Terapia epigenética en Galactosemia

Se considera la nutrigenómica como la disciplina que estudia los mecanismos moleculares que explican la distinta respuesta fenotípica a la dieta en función del genotipo. La nutrigenómica, por tanto, se centraría más en estudiar cómo los nutrientes regulan la expresión de los genes, cómo afectan los polimorfismos en la expresión y regulación, y cómo se interrelacionan estos cambios con aspectos proteómicos y metabolómicos.

Las mismas herramientas y métodos usados en farmagenómica (análisis de SNP, perfiles de expresión genética, proteómica, metabolómica, y bioinformática) están siendo utilizados para examinar las respuestas individuales a la alimentación. El progreso de la nutrigenómica y nutrigenética estará ligado a la utilización de dietas personalizadas para retrasar el inicio de la enfermedad y optimizar el mantenimiento de la salud humana.

Se identificaron niveles incrementados de estructuras a galactosiladas y monogalactosiladas y una disminución en ciertas estructuras digalactosiladas en los pacientes. La glicosilación anormalmente persistente de glicoproteínas séricas observada con datos de microarray indica una persistente dishomeostasis metabólica y disregulación génica en los GALT tratados.

La estricta restricción de la galactosa de la dieta claramente salva la vida en el período neonatal; pero la restricción estricta de galactosa a largo plazo puede contribuir a las anomalías sistémicas.

Enlace 1: https://www.kelloggs.es/content/dam/europe/kelloggs_es/images/nutrition/PDF/Manual_Nutricion_Kelloggs_Capitulo_16.pdf

Enlace 2: http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0212-16112005000400001

Enalce 3: https://metabolicas.sjdhospitalbarcelona.org/noticia/galactosemia-trastorno-monogenico-consecuencias-epigeneticas

Terapia regenerativa en Galactosemia

El trasplante hepático (TH) es el único tratamiento efectivo existente para las enfermedades hepáticas en fase terminal. La desproporción entre demanda y oferta de órganos constituye su principal limitación, planteando la necesidad de buscar alternativas de tratamiento.

El trasplante de hepatocitos humanos o trasplante celular hepático (TCH) constituye, en el momento actual, la mejor opción terapéutica puente al restablecimiento de la función hepática o al trasplante hepático. Consiste en trasplantar hepatocitos humanos totalmente diferenciados a un órgano receptor, en cantidad suficiente para que estos sobrevivan y restauren la función hepática normal, basándose en la capacidad de regeneración hepática.

El TCH consta básicamente de 4 pasos: el aislamiento de los hepatocitos a partir de injertos hepáticos descartados para TH, la preparación de las suspensiones celulares, la criopreservación de los hepatocitos aislados y, finalmente, su implante en el receptor.

Esta terapia se ha llevado a cabo en pacientes con insuficiencia hepática aguda de distintas etiologías con intención de sustituir o servir de puente al TH y en el tratamiento de pacientes pediátricos con errores congénitos del metabolismo con objetivo de reemplazar el déficit enzimático causante de la enfermedad.

Enlace 1: https://www.analesdepediatria.org/es-terapia-celular-hepatica-el-tratamiento-articulo-S1695403313002452

Técnicas de edición genómica para la galactosemia

Terapia de genes

Inserción de un gen normal, mediante un vector (viral), en las células del genoma del receptor, para que el  gen contenido en este vector se traduzca, para superar el bloqueo metabólico. Este enfoque se ve reforzado por células pluripotentes inducidas (IPS) desde las células somáticas individuales , no hay problema de incompatibilidad inmune. Al introducir un gen específico en las células IPS derivadas de los pacientes y seleccionar las colonias adecuadas de las células IPS antes de reintroducir  nuevamente a los pacientes.

gRNA / crRNA para la edición del genoma con vector WT SpCas9 o proteína cas9

Las siguientes secuencias de gRNA fueron diseñadas por el laboratorio de Feng Zhang en el Instituto Broad  para dirigirse de manera única al gen GALT dentro del genoma humano. Estas secuencias de gRNA son para usar con WT SpCas9, o como crRNA para usar con la proteína WT SpCas9, para introducir un DSB para la edición del genoma. Estas secuencias de sgRNA se validaron en Sanjana NE, Shalem O., Zhang F. Vectores mejorados y bibliotecas de todo el genoma para el cribado CRISPR

Vídeo 1: CRISPR

Enlace 1: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3253915/

Enlace 2: https://www.genscript.com/gRNA-detail/2592/GALT-CRISPR-guide-RNA.html

ADN recombinante en la naturalezay ADN recombinante en la enfermedad galactosemia

ADN recombinante en la naturaleza

Un ejemplo de DNA recombinante en la naturaleza es la conjugación de las bacterias mediante los pilis sexuales y la transferencia de plásmidos para así propagar la virulencia entre los Biofilms bacterianos, la Diabetes Mellitus tipo 2 y la relación con la patogenicidad bacteriana es importante para entender las complicaciones que conllevan como por ejemplo en una enfermedad periodontal.

ADN recombinante artificial

Esta invención crea una molécula de ADN recombinante que comprende el operón gal de Streptomyces lividans situado en un fragmento HindIII-SphI de aproximadamente 9 kb de ADN cromosómico de S. lividans 1326 o cualquier derivado de Streptomyces del mismo que funciona sustancialmente de la misma manera que el operón gal de Streptomyces presente en la naturaleza, en el contexto de la producción regulable de los productos génicos de galT, galE, galK; una molécula de ADN funcional ajena ligada operativamente a dicho operon; un vector de ADN recombinante que comprende dicha molécula de ADN, y,opcionalmente, comprende adicionalmente un replicón; un método para preparar una célula hospedadora transformada con dicho vector; el hospedador transformado preparado según dicho método;  para expresar dicha secuencia de ADN funcional que comprende cultivar dicho hospedador transformado bajo condiciones adecuadas, de tal modo que se expresa la secuencia de ADN funcional; y un método para regular la expresión de dicha secuencia de ADN funcional, que comprende cultivar dicho hospedador transformado bajo condiciones que regulan dicha expresión.

Fig 1. ADN recombinante

Vídeo 1. ADN recombinante

Enlace 1: http://www.actaodontologica.com/ediciones/2012/2/art-22/

Enlace 2: http://invenes.oepm.es/InvenesWeb/detalle?referencia=E87870026

Enalce 3: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15006357

Asesoramiento genético reproductivo en la patología galactosemia

El  asesoramiento genético es el proceso a través del cual:

• se evalúa su historial médico personal y el de su familia
• se solicitan pruebas genéticas
• se evalúan los resultados de estas pruebas
• se ayuda a los padres a entender los resultados para que tomen decisiones informadas sobre cómo proceder a continuación

El asesoramiento consiste en evaluar el riesgo genético asociado a la reproducción de la pareja que acude a la consulta, la comunicación del riesgo y consejos sobre las opiniones reproductivas.

El asesoramiento se comienza con:
1.- Realizar consentimiento informado.
2.- Desarrollo del árbol genealógico familiar.
La entrevista consta de cuatro objetivos:

1. Establecer una buena relación con el consultante.
2. Descubrir el modo de herencia genética.
3. Recopilar información sobre relaciones familiares.
4. Conocer preocupaciones y percepciones del consultante.

3.- Comunicación agradable y no crítica acerca de la enfermedad dando a conocer de que se trata al consultante.
5.- Asistencia: Ofrecer al consultante mas de una alternativa para elección de pruebas para el diagnostico presintomático o simple vigilancia médica.

6.- El diagnóstico debe proceder al asesoramiento, por lo cual se realizará el examen cromosómico para proporcionar una perspectiva general del genoma de igual manera técnicas moleculares para detectar una o varias mutaciones específicas.

Tener en cuenta que las pruebas de diagnóstico prenatal se precisa con un consentimiento informado explicando al consultante los riesgos significativos; de igual manera debemos nosotros como profesionales consultar a un equipo de salud con formación médica específica: genetistas clínicos, biólogos moleculares.

Es probable que a raíz de la consulta aparezca nuevas incertidumbres y los consultantes sufran de pesimismo funcional.

7.- Opciones reproductivas: En caso que el futuro hijo  predisponga a adquirir la enfermedad las medidas que se pueden tomar serán, la  modificación de la dieta o estilo de vida de la madre, diagnostico prenatal en una etapa posterior, diagnostico preimplantatorio, inseminación artificial por un donante, donación de óvulos, fertilización in vitro con embriones seleccionados, anticoncepción o esterilización, adopción de un hijo.

Fig. 1 Árbol genealógico de herencia autosómica recesiva.

Video 1. Asesoramiento genético.

Bibliografía: 

Pritchard, J. Genética Médica. Lo esencial de un vistazo. 3ra ed. Argentina: Buenos Aires. 2010.

Enlace 1: https://kidshealth.org/es/parents/genetic-counseling-esp.html

Galactosemia: Tratamiento

Debido a que, el contenido de lactosa en la leche se convierte en galactosa, el tratamiento se orienta a la supresión de la misma, así como de otros productos que, en su metabolismo final, conduzcan a la producción de galactosa. Para prevenir la acumulación de galactosa-1-fosfato y sus metabolitos en los tejidos.

• En  recién nacido con galactosemia clásica la lactancia materna está contraindicada, y se implementa tratamiento con una fórmula a base de proteína de soya.
• Las leches bajas en lactosa o deslactosadas están contraindicadas ya que la lactosa fue hidrolizada y la galactosa está libre y en cantidades considerables.
• Suplementar con calcio y vitamina D a pacientes cuyos requerimientos no sean cubiertos con el aporte dietético.

Imagen 1: Fuentes nutricionales para lactancia.

Cuadro 1: Alimentos permitidos y restringidos en galactosemia.

Enlace 1: http://www.imss.gob.mx/sites/all/statics/guiasclinicas/536GRR.pdf

Enlace 2: http://instituciones.msp.gob.ec/documentos/Guias/Guia_de_galactosemia.pdf

Galactosemia: Pruebas de diagnóstico y tamizaje confirmatorio de la enfermedad.

Diagnóstico de laboratorio

1. Concentración eritrocitaria de galactosa-1-fosfato. La concentración excede 2 mg/dL, usado para monitorizar la efectividad de la terapia. En la galactosemia clásica, 1a gal-1-P permanece elevada entre 2 a 5 mg/dL.

2. Galactitol. Puede ser medido en la orina, concentración mayor a 78 mmol/mol de creatinina es anormal.

3. Oxidación corporal total de C galactosa a CO2. La eliminación en la respiración de menos del 5% de  C galactosa como  CO2 dos horas después de la administración de  C-D galactosa define un fenotipo de un metabolito severo.

4. Método de dilución de isótopos por GC/MS (cromatografía de gases y espectrometría de masas). Se pueden realizar medidas experimentales de galactitol y galactonato en orina.

Vídeo: Decidir sobre las pruebas genéticas.

Confirmación diagnóstica

Galactosemia clásica (G/G) galactosemia

1.- Análisis de mutaciones blanco, identifica las ocho mutaciones más comunes GALT para galactosemia (G): p.Gln188Arg, p.Ser135Leu, p.Lys285Asn, p.Leu195Pro,p.Tyr209Cys, p.Ph e171Ser, 5kbdel, c.253-2A>G).

2.- Análisis de la secuencia. Identifica todas las mutaciones, intragénicas tipo deleción/inserción, mutaciones sin sentido, con pérdida de sentido, y mutaciones en el sitio de empalme.

3.- Análisis de delección/duplicación. Deleción de exones y multiexones GALT pueden ser detectados en individuos afectados.

Diagnóstico prenatal y preimplantacional.

Identificación previa de  mutaciones de la enfermedad en la familia. El diagnóstico prenatal de homocigotos mediante cuantificación de galactitol en líquido aminiótico; valorando  actividad enzimática en vellosidades coriónicas o amniocitos cultivados.

Imagen 1: Amniocentesis.

Tamizaje metabólico neonatal

Galactosemia detectada en los recién nacidos gracias al programa nacional de tamizaje. Este utiliza una muestra de sangre obtenida de talón para analizar la actividad de la enzima galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT) y cuantificar la concentración eritrocitaria de gal-1-fosfato y galactosa.

Imagen 2: Muestra de sangre obtenida en talón para tamizaje neonatal.

Enlace 1: http://instituciones.msp.gob.ec/documentos/Guias/Guia_de_galactosemia.pd

Enlace 2: https://lactosa.org/wp-content/uploads/2017/02/OC-2010_EFSAen-es.pdf

Galactosemia: Cuadro clínico

Signos:

• Edema, ascitis, ictericia
• Alteraciones hepáticas: hepatomegalia, hiperbilirrubinemia, hipertransaminasemia, alteraciones de la coagulación
• Alteraciones renales: acidosis hiperclorémica, glucosuria, albuminuria y aminoaciduria.  galactosuria
• Alteraciones oftalmológicas: Cataratas
• Sepsis, principalmente por E. Coli

Síntomas:

• Vómito
• Rechazo al alimento
• Falta de apetito
• Depresión neurológica
• Astenia
• Letargia.

 Enlace 1: http://instituciones.msp.gob.ec/documentos/Guias/Guia_de_galactosemia.pdf

Galactosemia: Alteraciones en la epigenómica

En los últimos años, se considera que los fenómenos epigenéticos motivados por la glicosilación defectuosa de las proteínas implicada en la expresión genética explican parcialmente los resultados clínicos variables a largo plazo de los pacientes y hermanos con mutaciones idénticas.

Los resultados a largo plazo de la galactosemia clásica (GAL) siguen siendo decepcionantes. No está claro si las complicaciones se deben principalmente a la toxicidad prenatal-neonatal o las anomalías persistentes de la síntesis de glicoproteínas y glicolípidos. Realizamos perfiles de expresión génica (transcriptoma T) para caracterizar genes alterados clave y grupos de genes de cuatro pacientes con GAL con resultados variables mantenidos con una dieta restringida a galactosa, en comparación con los controles. Se observaron perturbaciones significativas de múltiples vías de señalización celular, incluida la señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), la regulación del citoesqueleto de actina, la adhesión focal y la proteólisis mediada por ubiquitina. Se investigaron más a fondo una serie de genes significativamente alterados en la cohorte GAL, incluidos SPARC (osteonectina) y S100A8 (proteína de unión a calcio S100). El perfil de N-glicanos en suero completo y el estado de glicosilación de IgG de 10 pacientes tratados con GAL se compararon con el suero de control sano y la IgG utilizando una plataforma de HPLC analítica cuantitativa de alto rendimiento. Se identificaron en los pacientes niveles aumentados de estructuras agalactosiladas y monogalactosiladas y disminuciones en ciertas estructuras digalactosiladas. La glicosilación anormal persistente de las glucoproteínas séricas observada con los datos de micromatrices indica una disfomostasis metabólica persistente y una desregulación de los genes en la GAL "tratada". La restricción estricta de la galactosa en la dieta claramente salva vidas en el período neonatal; La restricción severa a largo plazo de galactosa puede contribuir a las anormalidades sistémicas en curso

Enlace 1:  https://lactosa.org/wp-content/uploads/2017/02/OC-2010_EFSAen-es.pdf

Enlace 2: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19952866

Galactosemia: Alteración en la traducción del gen GALT

La galactosemia es debida por mutación en el gen GALT situado en el brazo corto del cromosoma 9 (9p13),  codifica la enzima (uridiltransferasa galactosa-1-fosfato) que permite que el  organismo convierta la (galactosa-1-fosfato) a  glucosa. Se han identificado más de 300 mutaciones en el gen GALT, los cambios genéticos eliminan la actividad de la enzima. La mutación más frecuente reemplaza el aminoácido glutamina por el aminoácido arginina en la posición 188 de la enzima (Gln188Arg). Otra mutación sustituye el aminoácido leucina por el aminoácido serina en la posición 135 (Ser135Leu). Una mutación del gen GALT, conocida como variante Duarte (Asn314Asp o N314D), reduce pero no elimina la actividad de la enzima.

Clasificación de los tipos de galactosemia y genes afectados con sus respectivas enzimas. 

Video 1: Ejemplo de traducción de las células eucariotas.

Enlace 1: https://www.ivami.com/es/pruebas-geneticas-mutaciones-de-genes-humanos-enfermedades-neoplasias-y-farmacogenetica/1349-pruebas-geneticas-galactosemia-tipos-i-ii-y-iii-galactosemia-genes-i-galt-gale-i-y-i-galk1-i

Enlace 2: http://www.seqc.es/download/tema/6/2971/3778230/306382/cms/tema-10.galactosemia.pdf/

Galactosemia: Alteración en la transcripción del gen GALT

Magrangeas et al. (1998) establecieron la existencia de la elección del sitio poli (A) y el empalme por fusión de 2 genes adyacentes, que codifican la galactosa-1-fosfato uridilitransferasa y el receptor de la interleuquina-11 alfa-cadena (IL11RA; 600939), en células humanas normales. Esta unidad de transcripción de 16 kb contiene 2 promotores (el primero constitutivo y el segundo, 8 kb en sentido descendente, altamente regulado) y 2 señales de escisión / poliadenilación separadas por 12 kb. El promotor del gen GALT produce 2 ARNm, un ARNm de 1.4 kb que codifica GALT y un ARNm de fusión de 3 kb cuando el primer sitio poli (A) se empalma y se usa el segundo sitio poli (A). El ARNm de 3 kb codifica una proteína de fusión que contiene parte de la proteína GALT y la proteína IL11RA completa. El promotor GALT / transcripción de IL (IL) poli (A) resulta de la terminación permeable y el empalme alternativo.

Localización del gen GALT.

Video 1: Ejemplo de transcripción del ADN.

Enlace 1: http://omim.org/entry/606999

Galactosemia y su alteración genómica

Galactosemia

Se produce por las mutaciones en el gen GALT (galactosemia clásica tipo I), donde se elimina la actividad de la enzima producida a partir del gen GALT, evitando el  procesamiento normal de galactosa; otra mutación del gen GALT como la variante Duarte, reduce, pero no elimina la actividad de la enzima dando  características más leves de galactosemia.

La galactosemia tipo II es producto de las mutaciones en el gen GALK1, y las mutaciones en el gen GALE producen galactosemia tipo III.

Localización del gen GALT

Localización citogenética: 9p13

Localización molecular en el cromosoma 9: pares de bases 34, 646, 585 a 634, 650, 594.

Localización del gen GALK1

Localización citogenética: 17q24

Localización molecular en el cromosoma 17: pares de bases 73, 754, 017 a 73, 761, 279.

Localización del gen GALE

Localización citogenética: 1p36-p35

Localización molecular en el cromosoma 1: pares de bases 24, 122, 088 a 24, 127, 293.

Video 1 : Metabolismo de la Galactosa y enfermedades relacionadas.

Enlace 1: http://instituciones.msp.gob.ec/documentos/Guias/Guia_de_galactosemia.pdf

Galactosemia

Vídeo: Galactosemia.

La galactosemia es una enfermedad genética autosómica recesiva (AR). Las mutaciones de los genes GALE, GALK1 y GALT son las responsables de la galactosemia, ya que contienen instrucciones para elaborar las enzimas que son esenciales para el procesamiento de la galactosa obtenida de la dieta. Los recién nacidos vivos con galactosemia clásica pueden desarrollar síntomas en los primeros días de vida si consumen leche materna o artificial que contengan lactosa.

Fig 1: Modelo de herencia autosómico recesivo para la galatosemia.

Fig 2: Tabla para diagnóstico de la Galactosemia. 

Referencia:

Enlace 1: http://instituciones.msp.gob.ec/documentos/Guias/Guia_de_galactosemia.pdf
Enlace 2: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1518/

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